从零开始学PCR技术（四）：常见问题

PCR反应可能存在问题，比如无扩增条带、有扩增条带但是假阳性、出现非特异性条带或者条带出现拖尾现象，这是因为PCR反应存在多个关键环节：1、模板核酸的制备；2、引物的质量与特异性；3、酶的质量；4、PCR循环条件。任何一个环节出现差错都会导致PCR失败。

PCR常见的四种问题

现象：无扩增条带。

原因：

1.模板

模板中含有杂蛋白质、Taq酶抑制剂，模板上样量低或模板降解；
在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。
模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。

2.引物

引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因;
有些批号的引物质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增;
对策：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。

3.酶

4.Mg2+浓度

5.反应程序

6.靶序列变异

7.反应体积的改变

通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要摸索条件，否则容易失败。

现象：出现与目的扩增条带一致的条带。

原因：

靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及进样枪头等均应一次性使用。③必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。
引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。

现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。

**原因：**①引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体; ②Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关;③是酶的质和量，往往有些来源的酶易出现非特异条带而有些来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增;

**对策：**①必要时重新设计引物。②减低酶量或调换另一来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。

现象：产物在凝胶上呈涂抹带。

**问题：**模板浓度低，酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起；

**对策：**①减少或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适4当降低Mg2+浓度。④增加模板量，减少循环次数。

递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm高大约5 ℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1-2 ℃，直到退火温度低于Tm5 ℃；
特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势；
递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如AFLP、DNA指纹等。