从零开始学PCR技术（二）：Taq DNA酶

PCR技术改变了现代分子生物学，而Taq DNA聚合酶改变了PCR。

1986年，Mullis发明了PCR技术，当时使用的是大肠杆菌聚合酶I（Klenow），而这个酶是不耐热的，在反应体系温度升高使DNA变性的过程中会失去活性，因而每次循环都要加入新的聚合酶，操作十分麻烦，不能做到无人值守，成本也很高。

1988年，Saiki等将Taq DNA聚合酶应用于PCR技术，成功完成了DNA的自动扩增。Taq DNA聚合酶对于PCR的应用有里程碑的意义，PCR循环包括变性（90 °C左右）、退火（50°C左右）、延伸（70°C左右），每一步对温度的要求都不一样，多数酶在高温时即变性失活，然而该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，所以不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷。同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。

一、TAQ DNA聚合酶的来源

Taq DNA聚合酶是从一种叫做水生栖热菌（Thermus aquaticus）的嗜热细菌中分离出来的（Chien, 1976），这种细菌最初是从美国黄石国家森林公园的火山温泉中分离得到的，生长在70-75℃极富矿物质的高温环境中（Brock, 1969）。Taq DNA聚合酶具有极高的热稳定性，或许能够承受PCR的热变性步骤。1988年，Saiki等将Taq DNA聚合酶用于体外PCR扩增，不但实现了PCR自动化，还因为提高了退火和延伸温度而提高了产物特异性。这个研究鼓励了更多的技术人员使用Taq DNA聚合酶进行PCR，1989年，Lawyer等利用特异性探针从Taq DNA聚合酶基因文库中钓取了Taq DNA聚合酶全长基因，最终得到一个2499bp的编码序列，GC%高达68%，他们将该基因克隆到大肠杆菌中，通过诱导表达和分离纯化得到纯的Taq DNA聚合酶。

二、TAQ DNA聚合酶的结构与功能

Taq DNA聚合酶属于聚合酶家族A，是一个单体酶，它与大肠杆菌聚合酶I（pol I）具有很高的结构相似性。1995年，Kim等公布了Taq DNA聚合酶的晶体结构，为解释其耐热性、催化活性及分子改造奠定了基础，下面将其结构特点罗列如下：

Taq DNA聚合酶的三维结构

① Taq DNA聚合酶包括三个结构域，1-291：5’-3'外切核酸酶结构域，292-423：该结构域对应于pol I的3’-5'外切酶结构域，两者虽然具有结构相似性但无序列相似性，因此Taq DNA聚合酶不具有3’-5'外切活性，424-832：5’-3'聚合活性结构域。

② 5’-3'外切结构域是一个功能完整的独立结构域，该结构域的缺失不会使Taq丧失聚合活性，但对酶的催化性能有一些影响。Barnes（Barnes, 1992）构建了一个N端236aa缺失的Taq突变体，发现仍具有完整的聚合活性，且保真性有所提高。Lawyer等（Lawyer, 1993）发现N端289aa缺失的大片段耐热性比全长酶更高，且盐离子耐受能力也提高了，但持续合成活性降低十倍。Merkens等（Merkens, 1995）认为Klentaq持续合成能力的下降与5’-3'外切结构域结合DNA有关，结合作用阻止了酶与DNA底物的彻底解离，后来很多研究人员也支持这一观点。此外，5’-3'结构域还对Taq DNA聚合酶的底物特异性有很大影响，5’-3'结构域删除片段对引物3’端错配敏感性显著下降，对ddNTP的掺入能力增强。从三维结构上看外切结构域与聚合结构域距离很远（大于70Å），很难理解它是如何与聚合结构域协作的，Kim等也无法解释这个现象，他们推测5’-3'外切结构域在溶液中的位置与晶体中不同，要更接近聚合结构域。

③ Taq DNA聚合酶3’-5'外切酶结构域比pol I短，缺少4个长度8-27aa的loop结构，并且pol I中担负金属离子结合的关键残基D424、D501、D355、E357在Taq中被替换为L356、R405、G308、V310，酸性残基上的羧基能够与金属离子形成离子键，被替换后无法再与金属离子结合，Kim等推测这是Taq DNA聚合酶失去3’-5'外切酶活性的主要原因。

④ 5’-3'聚合活性结构域像一只右手，包括拇指(Thumb)、手掌(Palm)、手指(Fingers)结构，催化活性位点是Asp610、Asp785和Glu786位于Palm结构域中，手指结构中的O-α螺旋对底物特异性有重要作用，拇指结构中的I-α螺旋也和底物结合密切相关。

（Eom S H, 1996）Klentaq1-DNA复合物结构

三、TAQ DNA聚合酶的特点

Taq DNA聚合酶基因全长2496个碱基，编码832个氨基酸，分子量94kD，预测的等电点约为6.0，理论总平均亲水指数为-0.282。现将其酶学特点罗列如下：

① 良好的耐热型，最适催化温度在75-80℃，95℃半小时后仍保留50%以上的活性。Taq DNA聚合酶是Mg2+依赖型聚合酶，最适浓度范围是2-4mM。Taq DNA聚合酶还需要单价阳离子，在10-55 mM KCl中具有最大活性。有研究认为Na+会抑制聚合酶活性，但有些研究中聚合酶在Na+环境中也能够正常扩增。

② 5’-3'聚合活性，该特性对温度具有较高的敏感性，70℃时，Taq DNA聚合酶能够以60nt/s的速率聚合DNA链，55℃时降为24nt/s，37℃时为1.5nt/s，22℃时基本停止扩增（Innis, 1988）。

③ 5’-3'外切核酸酶活性，Taq DNA聚合酶是少数具有这一活性的DNA聚合酶之一。1991年，Holland等（Holland, 1991）利用Taq DNA聚合酶的5’-3'外切活性切除5’端放射性标记的DNA探针，通过放射性信号的变化，实现PCR产物的特异性检测。这一研究，为qPCR技术的发展奠定了基础，从此，Taq DNA聚合酶也成了探针法qPCR技术的指定聚合酶。

④ 部分PCR产物3’末端加A，1988年，Clark等发现Taq DNA聚合酶会在新生链的3’末端添加无模板核苷酸，这一特征使Taq DNA聚合酶的PCR产物能够直接用于TA克隆。但是实际应用时，情况要复杂得多， 1993年，Hu等报道了8种聚合酶3’末端延伸的情况，发现Taq DNA聚合酶在PCR产物的3’末端添加A或其它碱基。1996年，Magnuson等系统性研究了Taq DNA聚合酶3’末端加A的概率，发现3’末端加A并不高，与反向引物5’端碱基种类密切相关，他们还指出这种不完全的碱基添加不利于在等位基因分形和TA克隆。

⑤ 无3’-5'校正活性，虽然Taq DNA聚合酶与大肠杆菌聚合酶I有很高的结构相似性（包括3’-5’外切核酸酶结构域），但它缺乏3’-5'外切核酸酶活性，这降低了其在PCR扩增中的忠实性。关于Taq DNA聚合酶的错误率，不同的报道差异很大，Tindall等（Tindall, 1988）测定的突变率为1/9000，Cline等（Cline, 1996）测定的突变率为8.0±3.9×10-6。这种差异的原因有两个：一、测试方法不同，比如lacZα和lacI，二、酶纯度和实验条件有差异。抛开这些错误率数据，实事求是的讲，我使用Taq DNA聚合酶多年，用于一般性扩增保真性还可以，一般1-2.5kb的目标片段，挑取两个克隆基本能得到正确的克隆。用于困难模板扩增时，错误率较高，挑取4-6个克隆子基本也能得到正确克隆。

(上述所列的酶的催化性能参数，在不同的研究中是有较大变化，因为可能使用的酶纯度不同，或者使用的buffer不同，模板、引物、仪器、反应体系甚至PCR管壁的薄厚都会导致PCR表现的差异。这些数据只是一个参考，实际使用中应以试验结果为准。)

四、TAQ DNA聚合酶的应用

Taq DNA聚合酶发现了几十年，不但没有被取代，反而在分子生物学领域具有越来越广泛的应用。这一方面依赖于它自身的功能和特点，另一方面也依赖于研究人员对其不断地改造。通过定点突变、结构域重组、定向进化等技术，Taq DNA聚合酶获得了许多催化性能改善或展现新功能的突变体，拓宽了酶的应用范围。下面是Taq DNA的一些应用领域。

热循环PCR
易错PCR
热启动PCR
位点特异性PCR（SNP检测）
qPCR（Taqman法）
TA克隆
Sanger测序
二代测序

五、总结

Taq DNA聚合酶已经被改造成了各种类型以适用于不同的应用领域。在这里我们考虑它对靶向扩增子测序的影响。

PCR错误的影响。由于Taq DNA聚合酶无3’-5'校正活性，因此在PCR延伸过程中可能发生错误，导致碱基突变。但这种错误率低于千分之一,而扩增子大小通常只有几十到几百bp。因此PCR错误的影响是很少的。
末端加A的影响。事实上Taq DNA聚合酶不只会向PCR产物末端加A，还会加其他碱基，这与反向引物5’端碱基种类密切相关。这在实验和生信分析过程中需要注意。